Udoskonalone światło-mikroskopowe wykrywanie zarodników mikrosporydowych w stolcu i aspirynach dwunastnicy ad

Po tym jak składniki stały przez 30 minut w 3 ml lodowatego kwasu octowego, zmieszano je ze 100 ml wody destylowanej. Po barwieniu szkiełka płukano w kwasowym alkoholu (4,5 ml kwasu octowego; 995,5 ml 90% alkoholu etylowego) przez 10 sekund, a następnie krótko przepłukiwano 95% alkoholem. Rozmazy były następnie kolejno odwadniane w 95% alkoholu przez 5 minut, 100% alkoholu przez 10 minut i Hemo-De (substytut ksylenu, Fisher Scientific, Pittsburgh) przez 10 minut. Stworzono 100 lekkopikroskopowych pól zanurzenia oleju (powiększenie × 1000) na szkiełko; każdy slajd wymagał średniego czasu czytania około 10 minut. Rozmazy przygotowane przy użyciu zmodyfikowanej metody stężeń stolca formalina-octan etylu Ritchiego, metoda flotacji cukru 28, 29 metodą flotacji chlorku sodu, 26 lub uproszczoną procedurą koncentracji zarodników, która okazała się obiecująca w badaniu pilotażowym badania zostały ocenione i porównane z nieskoncentrowanymi rozmazami kału. Zbadano również dwie dodatkowe metody wirowania przy użyciu gradientów sacharozy i Percoll.31
Próbki stolca do mikroskopii elektronowej utrwalono w 10% formalinie, a nadmiar resztek kału usunięto przez kolejne przemywanie w dejonizowanej wodzie, a następnie zmodyfikowaną flotację cukru i szybkie wirowanie. Próbki przeniesiono następnie do probówek Microfuge, przemyto 0,1 M buforem fosforanowym (pH 7,4) i wtórnie utrwalono w 2% tetratlenku osmu na dwie godziny, ponownie zawieszono w utrwalaczu i odwirowano przy 9000 xg przez pięć minut w mikrowirówce Beckman (Beckman Instruments , Palo Alto, Kalifornia). Po przemyciu i odwodnieniu w stopniowanych roztworach etanolu, peletki osadzono w żywicy Eponate 12 (Ted Pella, Redding, Calif), podzielono, zabarwiono 2% octanem uranu w wodzie i cytrynianem ołowiowym Reynoldsa i zbadano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (Zeiss EM 10C, Zeiss, Thornwood, NY).
Ocena epidemiologiczna
Tabela 1. Tabela 1. Próbki stolca mające dodatni mikrosporydia od pacjentów zakażonych wirusem HIV włączonych do prospektywnego badania. Procedurę wykrywania przetrwalników oceniano, badając 215 próbek od 134 pacjentów zakażonych wirusem HIV, którzy zostali włączeni do prospektywnego badania przypadków infekcji oportunistycznych jelitowych w powiązanych klinikach (Grady Memorial Hospital, Veterans Affairs Medical Center i Crawford Long Hospital) oddziału Chorób Zakaźnych, Wydział Medycyny, Emory University School of Medicine (Atlanta). Pacjenci zostali zaklasyfikowani jako chorzy z przewlekłą biegunką (biegunka trwająca miesiąc lub dłużej), ostra biegunka (trwająca krócej niż miesiąc) lub bez biegunki (Tabela 1). Przewlekła biegunka została zdefiniowana jako niewyjaśniona , jeśli nie zidentyfikowano żadnych patogenów bakteryjnych, a trzy kolejne badania stolca nie wykryły pasożytniczych patogenów innych niż mikrosporydia. Biegunkę definiowano jako upływ trzech lub więcej luźnych lub wodnistych ruchów jelit w jednym 24-godzinnym okresie.
Próbki stolca zostały zebrane przez pacjentów i umieszczone w trzech fiolkach – jedna z 10 procentami formaliny, druga z polialkoholem winylowym (Para-Paks, Meridian Diagnostics, Cincinnati) i jedna bez środka konserwującego
[podobne: 28 tygodni później cda, pokrzywa indyjska w aptece, pojemnosc minutowa serca ]